獲得高質(zhì)量的高爾基體分離物，對(duì)于進(jìn)一步分析和理解這種細(xì)胞器至關(guān)重要。Himac 目前隸屬于 Eppendorf集團(tuán)，擁有 60 多年定制研發(fā)落地式超速離心機(jī)的豐富經(jīng)驗(yàn)。在本應(yīng)用說(shuō)明中，我們將采用一系列差速離心和非連續(xù)蔗糖密度梯度離心操作，使用 Himac CP80-NX離心機(jī)（搭配 P32ST 和 P40ST 水平轉(zhuǎn)子）從水稻幼苗中分離高爾基體。
 

圖 1：搭載 P32ST 和 P40ST 型水平轉(zhuǎn)子的 CP 系列超速離心機(jī)

120 多年前，卡米洛 · 高爾基（Camillo Golgi）首次發(fā)現(xiàn)了真核細(xì)胞的高爾基體。之后，（電子）顯微技術(shù)的發(fā)展揭示了高爾基體的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，而進(jìn)一步的生化分析則闡明了細(xì)胞內(nèi)這種細(xì)胞器的各項(xiàng)功能 [2]。在高等生物細(xì)胞中，作為分泌途徑的一部分，高爾基體負(fù)責(zé)合成復(fù)合多糖體、加工蛋白質(zhì)并將蛋白質(zhì)分配到其他細(xì)胞器中（圖 2）[1]。
 

葉綠體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

(1) 通過(guò)TOC-TIC復(fù)合體的正常轉(zhuǎn)運(yùn)途徑
(2) 通過(guò)分泌途徑的特殊轉(zhuǎn)運(yùn)途徑（ER-高爾基體）
圖 2：植物細(xì)胞通過(guò)以下途徑完成蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)：
（1）Toc-Tic復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制（2）高爾基體和分泌途徑
 

α- 淀粉酶就屬于此類蛋白質(zhì)，它是一種負(fù)責(zé)植物內(nèi)淀粉分子水解的糖苷酶。研究表明，α- 淀粉酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）核糖體處合成并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中糖基化后被輸送到高爾基體進(jìn)行低聚糖改性 [3]。然而，由于高爾基體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）等其他膜系統(tǒng)形成了復(fù)雜結(jié)構(gòu) [2]，因此分離這種細(xì)胞器的不同部分尤其困難。事實(shí)上，高爾基體膜的某些部位還經(jīng)常會(huì)被液泡等其他相連的膜系統(tǒng)污染 [2]。因此，在本應(yīng)用說(shuō)明中，我們將使用一系列差速離心和密度梯度離心操作（富集特定膜系統(tǒng)的最成熟技術(shù)之一）[2]，從水稻幼苗中獲取高爾基體膜。用這種技術(shù)可以獲取高純度、高質(zhì)量提取物并用于質(zhì)譜等進(jìn)一步的下游分析。下面我們將詳細(xì)介紹使用 CP80-NX 超速落地式離心機(jī)（搭配 P32ST 和P40ST 轉(zhuǎn)子）分離獲取高質(zhì)量高爾基體的過(guò)程。

材料與方法
所用材料
CP80NX 超速離心機(jī)搭配以下水平轉(zhuǎn)子：
1. P32ST 型水平轉(zhuǎn)子，適用于 40 mL PET 離心管
2. P40ST 型水平轉(zhuǎn)子，適用于 13 mL PET 離心管

第 1 步：
使用 P32ST 型水平轉(zhuǎn)子 （40 mL PET 離心管） 和 P40ST 型水平轉(zhuǎn)子 （13 mL PET 離心管），完成微粒體純化過(guò)程。
1. 在 4°C 條件下，使用水平轉(zhuǎn)子，在 40 mL PET 離心管中以15,000 x g 的速度離心純化水稻提取物 30 分鐘，并移除沉降物。
2. 在 13 mL PET 離心管中，底部鋪墊 1 mL 50% 濃度蔗糖溶液，中間層裝入 1 mL 15% 蔗糖溶液，頂部裝入 11 mL 上清液。15% 蔗糖溶液置于 1 mL 50% 蔗糖墊層之上，將11 mL 上清液裝入 1 mL 15% 蔗糖溶液頂部。
3. 在 4°C 條件下，以 100,000 × g 的離心力離心 3 小時(shí)，然后收集 50% 蔗糖墊層溶液中截留的微粒體部分。

第 2 步：
使用 P40ST型水平轉(zhuǎn)子 （13 mL PET離心管），從微粒體部分純化高爾基體。
1. 使用手持糖量?jī)x，利用 60% 蔗糖緩沖液將收集的微粒體蔗糖溶液密度中和至 42%。在該溶液上層裝入 1-2 mL 其他非連續(xù)蔗糖密度梯度，每個(gè)梯度由 1 mL 濃度為 26%、30%、34% 和 38% 的蔗糖層組成。隨后，小心地加滿水至13 mL。
2. 4°C，100,000 × g 離心 3 小時(shí)，然后迅速收集漂浮在34% 和 38% 蔗糖層之間界面相的高爾基體部分（1）。
3. 再次將收集的高爾基體部分中和至蔗糖密度 42%，然后再次裝入 1-2 mL 不連續(xù)的蔗糖梯度溶液，每個(gè)梯度由 1 mL 26%、30%、34% 和 38% 的蔗糖層組成。小心加滿水至13 mL。
4 .4°C， 100,000 × g 離心 3 小時(shí)，然后收集漂浮在 34% 和38% 蔗糖層之間界面相的高爾基體部分（2）。

通過(guò)使用細(xì)長(zhǎng)的 13 mL 離心管完成兩次浮選離心，即可從微粒體中分離出高純度的高爾基體?；厥蘸蟮母郀柣w部分（2）可用于實(shí)驗(yàn)和印跡分析。所有蔗糖濃度單位均為質(zhì)量百分比（w/w）。

結(jié)果與討論

非連續(xù)密度梯度離心法是分離或富集亞細(xì)胞成分的標(biāo)準(zhǔn)方法。在大多數(shù)情況下，我們利用沉降系數(shù)或特定密度的差異來(lái)獲得分離物。在細(xì)胞器的分離應(yīng)用中，決定這些分離參數(shù)的主要因素是相應(yīng)膜的組成成分。獲得高純度的分離物通常比較困難，這一點(diǎn)在與其他膜系統(tǒng)緊密相連的高爾基體 [2] 上尤為明顯。

因此，高純度的高爾基體膜對(duì)于分析和研究高爾基體蛋白質(zhì)組 [1] 或細(xì)胞器內(nèi)特定的蛋白質(zhì)至關(guān)重要。

本文使用了兩種不同型號(hào)的水平轉(zhuǎn)子，配合一系列非連續(xù)蔗糖密度梯度離心步驟，高效可靠地獲得了高質(zhì)量的高爾基體分離物。

在棄掉第一道離心步驟中的細(xì)胞碎片后，將上清液裝入第一個(gè)非連續(xù)的蔗糖梯度上（見圖 3）。在 15% 和 50% 的蔗糖相之間為富集的微粒體部分。隨后，微粒體部分通過(guò)兩次非連續(xù)的蔗糖梯度浮選分離步驟而進(jìn)一步被純化，其中高爾基體沉積在梯度為 34% 和 38% 的蔗糖相之間（圖 3）。Asakura 等人 [4] 的研究表明，經(jīng)過(guò)第二次浮選分離操作后，高爾基體部分的純度顯著提高?？梢圆捎妹庖哂≯E法對(duì)以下標(biāo)記酶進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而對(duì)高爾基體的質(zhì)量進(jìn)行分析：例如 UGPase（尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶：細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)）、RbcL（二磷酸核酮糖羧化酶 長(zhǎng)鏈：質(zhì)體）、COXII（細(xì)胞色素 C 氧化酶亞基 2：線粒體）和 ARF（腺苷核糖基化因子：高爾基體）。

結(jié)論

水平轉(zhuǎn)子 P32ST 和 P40ST 是分離高爾基體的理想選擇，兩者搭配可以實(shí)現(xiàn)從 40 mL 大容量離心管到 13 mL 小容量離心管的流暢切換，同時(shí)保證了優(yōu)秀的離心效果。Himac 13 mL PET離心管采用了特殊的細(xì)長(zhǎng)造型，可實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)的浮選距離，從而提升了高爾基體部分的純度。此外，轉(zhuǎn)子采用的頂部裝載設(shè)計(jì)，便于完成蔗糖梯度處理的精細(xì)操作，并且可以將意外混合污染的風(fēng)險(xiǎn)降至最低。